技術(shù)文章/ARTICLES

    常有剛剛接觸ELISA實(shí)驗(yàn)的新手說操作復(fù)雜，步驟化很多，不易實(shí)驗(yàn)。其實(shí)當(dāng)我們掌握了其中的技巧與注意避免之后就會簡單很多。：
1. 嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。ELISA試劑盒
2. 所有液體組分使用前充分搖勻。
3. 實(shí)驗(yàn)前，產(chǎn)品應(yīng)保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
·評價的方法
    1.發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查，這是目前國內(nèi)外常見的形式，采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實(shí)驗(yàn)室，各實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定的日期進(jìn)行檢驗(yàn)，并將結(jié)果報至組織者(部、省臨檢中心)。組織者通過統(tǒng)計分析，再將評價結(jié)果寄回實(shí)驗(yàn)室，使其了解工作質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)問題，提高質(zhì)量。其缺點(diǎn)為由于各實(shí)驗(yàn)室吃小灶或互相打修改結(jié)果而達(dá)不到真正評價作用。
2.現(xiàn)場調(diào)查，事先不通知，臨時派出人員到各實(shí)驗(yàn)室，規(guī)定采用常規(guī)方法，檢測一組標(biāo)本，進(jìn)行評價。這種方法可以解決實(shí)際問題，進(jìn)行現(xiàn)場指導(dǎo)，組織者常因人力、物力的原因而不能經(jīng)常性進(jìn)行。

·實(shí)驗(yàn)記錄
1.所有實(shí)驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔；
2.所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊；
3.原始登記表應(yīng)記錄試劑來源、批號；
4.質(zhì)控血清的來源及測定值并注明是否在控；

    抗體 在 ELISA檢測試劑盒 中應(yīng)用的抗體可分為多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）。多抗取白免疫動物的抗血清，制備較簡單，但抗血清成分復(fù)雜，除含針對抗原（多個表位）的抗體外，還含有多種其他抗體，親和力和特異性相對要低于單抗，且制備周期長，批間差異較大。而單抗僅針對抗體的單一表位，親和力和特異性均較多抗高，且制備技術(shù)成熟，產(chǎn)量大，批間差異小，但結(jié)合位點(diǎn)的單一也正是其弱點(diǎn)之所在，在雙抗體夾心法中，如包被和指示抗體使用同一單抗，則由于結(jié)合位點(diǎn)的缺乏，容易造成假陰．性結(jié)果。在使用雙單抗一步法時，應(yīng)注意抗原過剩時的“鉤狀效應(yīng)"ELISA試劑盒
    2．抗原 在ELISA中應(yīng)用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有3類，即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。自然抗原的純度不高，特異性不強(qiáng)；合成抗原一般為多肽片段，缺乏天然抗原所具有的立體結(jié)構(gòu)表位，親和力不高，可能導(dǎo)致相應(yīng)表位的抗體漏檢；基因重組抗原具有安全、特異性強(qiáng)、親和力高、產(chǎn)量大等特點(diǎn)，是一種比較理想的抗原，但其純化比較困難。
    3．包被 將免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合于固相載體上的過程稱為包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纖維薄膜等；常用的方法有吸附法、化學(xué)交聯(lián)法及親和素-生物素間接包被法，特別是后一方法，效率高，ELISA檢測試劑盒而且可用以包被不易吸附在固相上的各種免疫活性物質(zhì)。具體做法是先將鏈霉親和素包被在固相載體上，然后使與生物素化的抗原或抗體與之結(jié)合。由于親和素與生物素之間的高親和力，抗原或抗體即間接結(jié)合在親和素包被的固相上.
    4．酶和底物 在 ELISA檢測試劑盒 中zui常用的酶為HRP和ALP。
（1）HRP：是一種糖蛋白，含糖量約18％，分子量為44kD，在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合形成一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為五色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，是酶的活性基團(tuán)，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用純度值（reinhartzahl，RZ）表示，RZ＝A403nm／A275nm，即403nm的吸光度與280nm的吸光度之比，高純度HRP的RZ值應(yīng)≥3．0。HRP質(zhì)量的另一重要指標(biāo)是酶活力，以單位（unit，U）表示。用于標(biāo)記的HRP比活性應(yīng)≥250U／mg。HRP的作用底物為H202，催化下列反應(yīng)；ELISA試劑盒