技術文章/ARTICLES

1. 亮發光桿菌和培養基從穩定運行的生物脫硫脫氮 EGSB-DSR 反應器的不同高度采集污泥。將采集的樣品 50 mL (固體 5.0 g)放入 500 mL 滅菌的錐形瓶中，加入無菌水稀釋到 250 mL，放入玻璃珠 20−25 個，在搖床中以 220 r/min 振蕩 24 h。將菌膠團或土壤顆粒振碎，制成菌懸液。采用 Hungate 厭氧滾管技術篩選功能微生物，培養基的配方(g/L)：Na2S·9H2O 0.50，無水乙酸鈉 0.28，NaHCO3 1.50，NH4Cl 0.05， KNO3 0.15， K2HPO4 0.05。采用 4 mol/L NaOH 將 pH 調至 7.5。在配制培養基過程中全程采用80%氮氣吹脫以保證厭氧環境。制作固體培養基時，在液體培養基中加入 2%左右的瓊脂。

2. 菌種的分離與篩選吸取 1 mL 的污泥菌懸液，用無菌水稀釋至 10–4。接入固體培養基中在恒溫培養箱 30 ºC 培養 5 d 至培養基上出現單菌落為止。挑取培養基上的單菌落轉入液態分離培養基，進行擴大培養，在恒溫培養箱 30 ºC 培養，培養周期為 5 d 左右，培養基出現白色混濁為宜。用接種針粘取液態培養基的菌種，在固態培養基上進行平板劃線培養。在恒溫培養箱 30 ºC 進行培養，然后挑取單菌落轉入液態培養基中。重復以上分離步驟 5 個周期，直至分離出單一菌落。

3. 菌株 A2 形態特征以及 16S rRNA 基因的測序鑒定采用透射電鏡的方法觀察菌株的形態特征：取純化的液體培養物一滴置于銅網上，15−20 min 后取銅網于 2%的磷鎢酸鈉溶液中負染色 40 s，取出銅網置于干燥的濾紙上劃線分區，晾干。將此銅網置于透射電鏡的樣品室，觀察細菌形貌。之后進行革蘭氏染色實驗。采用天根公司的細菌基因組提取試劑盒提取菌株 A2 的細菌基因組 DNA，然后用正向引物 F8 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和反向引物 R1492 (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行細菌的 16S rRNA PCR 擴增，反應體系(50 μL)：模板 DNA 3 μL，正向引物(20 pmol/L) 2 μL，反向引物(20 pmol/L) 2 μL，dNTP mixture (1.95 mmol/L) 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 1.5 μL，10×Buffer 3 μL，ddH2O 36 μL。 PCR 擴增條件：95 °C 5 min；94 °C 1 min，60 °C 30 s， 72 °C 1 min，35 個循環；72 °C 10 min；4 °C 保存。將 PCR 擴增的產物進行測序，測序結果在 NCBI 數據庫中比對分析，并用軟件 Mega 5.0 進行系統進化分析。

4. 菌株 A2 的異養反硝化脫硫特性將亮發光桿菌對數期的菌液 10 mL 轉接入配制好的液體培養基 50 mL 中，立即用離子色譜和分光光度計檢測 S2–、S2O3 2–、SO4 2–、NO3 – 、NO2 – 和碳源濃度并記錄，再按原篩選的條件進行培養。每隔 3 h 檢測一次，直至這 6 個指標的濃度不再變化。
Gambogic acid    藤黃酸    2752-65-0    20mg

Leucoside    堪非醇3-O-桑布雙糖苷    27661-51-4    20mg
Scularin    野黃芩苷    27740-01-8    20mg
Geniposidic acid    京尼平苷酸    27741-01-1    20mg
Isosteviol    異甜菊醇    27975-19-5    20mg
Cimigenoside    升麻環氧醇苷    27994-11-2    20mg
亮發光桿菌