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    從費氏弧菌發光桿菌提取質粒向大腸桿菌DH10B電轉化方法

    點擊次數:1554  更新時間:2017-07-13

    費氏弧菌發光桿菌制做選擇平板LB+25 mg/l Kan。
    ②核對好要轉化的質粒dna,在15 ml Falcon tube 和cuvette(電轉化用的石英樣品槽,兩面磨光,兩面磨砂)標好質粒名稱。將Falcon tube、cuvette、質粒DNA、SOC培養基按順序對應置于冰上預冷或解凍。轉化前將大腸桿菌(45 µl aliquot of E. coli DH10B Cells)置于冰上解凍(約3-5 min)。
    一、將冰桶移置超凈工作臺上,取200-1000 µl、20-100 µl、0.5-10 µl 移液器(Fubbouoette)到超凈工作臺上。先用0.5-10 µl移液器取0.5-2 µl質粒DNA到大腸桿菌細胞內,再用調節到50 µl 的(20-100 µl移液器)上下吹吸數次。在冰上放置2 min。
    二、用調節到50 µl 的(20-100 µl移液器)將質粒DNA和大腸桿菌細胞混合液轉移到電轉化石英樣品槽底凹槽的中央,在桌面上輕擊數次使之分散。在冰上放置1-2 min。
    三、先用紙將樣品槽擦拭一下,移到2.5 kV電脈沖發生器上,同時用1000 µl移液器吸好SOC培養基,約4.5-5 sec后鳴叫聲停后,立即加入樣品槽內(吹吸一次或不吹吸)。
    四、將細胞懸浮液從樣品槽中取出并加入15 ml Falcon tube,在37℃,200/min振蕩培養1 h。在樣品槽中加滿自來水,以便清洗。
    五、在此期間,可制做選擇平板LB+25 mg/l Kan。
    六、將培養后的轉化大腸桿菌懸液在超凈工作臺上全部倒入1.5 ml微量離心管,13000 rpm離心30 s(或到達13000 rpm后離心15 s)。用費氏弧菌發光桿菌1000 µl移液器取出大部分的上清,再用50 µl移液器全部棄掉剩余的上清,之后吸取100 µl lb培養基重新懸浮沉淀,上下吹吸數次到均勻。
    七、對三角鐵焚燒滅菌,標記選擇平板,取30 µl LB培養基加入平板中心,再取重新懸浮后的轉化大腸桿菌30 µl加入平板中心。待三角鐵冷卻后,在平板上研磨,至無可見液體為止。注意三角鐵一定要冷卻,或先在無菌液的平板上研磨加速冷卻。
    八、將選擇平板在37℃下培養,1天后觀察轉化效果。
    九、清洗電轉化樣品槽。先用自來水吸瓶沖洗十多次,之后加入酒精,放置1 h,之后用蒸餾水沖洗數次,甩干后,費氏弧菌發光桿菌水平放置在濾紙上晾干。

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